Projektlaufzeit: 2003 - 2004

Leitung:

Dr. rer nat. Burkhard Schmidt
Univ.-Prof. i.R. Dr. rer. nat. Ingolf Schuphan

Bearbeitung:

Nicole Joußen

Auftraggeber:

Eigenfinanzierung

Hintergrund:

Pflanzliche P450-Enzyme besitzen sowohl Aufgaben im Primär- und Sekundärstoffwechsel der Pflanzen als auch in der Metabolisierung von Xenobiotika einschließlich Herbiziden. Da z.B. Mais eine natürliche Resistenz gegenüber dem Triazin-Herbizid Atrazin aufweist, konnten suszeptible Wildpflanzen, die bei Feldanbau neben den Kulturpflanzen aufkommen, durch Anwendung des Herbizids ohne Schädigung der Kulturpflanzen selektiv bekämpft werden (Herbizidselektivität). Kulturpflanzen wie z.B. Tabak und Kartoffel, die keine oder nur eine unzureichende natürliche Resistenz gegenüber einem bestimmten Herbizid besitzen, können durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation mit einem Säuger-P450-Isoenzym (z.B. CYP1A1 oder CYP1A2) Herbizid-resistent werden. Seit einigen Jahren gibt es in dieser Richtung Bestrebungen, P450-transgene Pflanzen herzustellen. Aufgrund der überlappenden, breiten Substratspezifität des jeweils eingebrachten Säuger-P450-Isoenzyms (Ratte, Mensch) wird in den transgenen Pflanzen meist eine multiple Resistenz gegen verschiedene Herbizide mit unterschiedlichen Strukturen und Wirkmechanismen beobachtet. Vor der Vermarktung von transgenen Pflanzen müssen diese in Feldversuchen getestet werden.
Dabei wird die Verträglichkeit des Genproduktes, die Eigenschaften der modifizierten Pflanze, die Expressionsstabilität des eingebrachten Fremd-Gens und mögliche ökologische Auswirkungen untersucht. Zusätzlich sollte neben der Substratspezifität des fremden P450-Isoenzyms gegenüber Xenobiotika getestet werden, ob pflanzliche Sekundärmetaboliten als Substrate in Frage kommen. Außerdem sind mögliche Einflüsse auf den normalen Stoffwechsel der Pflanzen von Interesse, die sich auf den Phänotyp der Pflanzen auswirken können. Z.B. wurde bei Cyp2c14-transformierten Tabak-Pflanzen (aus Kaninchen) eine verstärkte Seneszenz beschrieben, die sich in einem verringertem Chlorophyll-Gehalt, einem erhöhten Gehalt an Abbauprodukten der Lipid-Peroxidation und einem Abbauprodukt des Nornicotins und in einer Abnahme des Nicotin-Gehaltes äußerte. Außerdem wuchsen die Pflanzen langsamer und brauchten mehr Zeit zur Bewurzelung.
Dies sind Anzeichen dafür, dass das Einbringen eines Fremd-P450-Gens in Tabak über die oxidative Veränderung der Membranlipide oder -sterole und damit über die Veränderung der Membranstruktur, durch einen hormonellen Eingriff durch Umsetzung eines Brassinosteroids oder die Unterdrückung endogener P450-Gene möglicherweise schwerwiegende metabolische Auswirkungen zur Folge haben kann.
Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob die Agrobakterien-vermittelte Transformation von Tabak mit der cDNA des humanen CYP1A2 Auswirkungen auf den endogenen Nicotin-Gehalt der Pflanzen zur Folge haben. CYP1A2 gehört dabei neben anderen Isoenzymen im Gegensatz zu den Hauptenzymen CYP2A6, CYP2B6 und CYP2D6 zu den Isoenzymen, die Nicotin nur bei hoher Substratkonzentration umsetzen. Nicotin besitzt dabei als natürliches Insektizid eine wichtige ökologische Funktion in der direkten Abwehr von Fraßfeinden, wie Insekten oder Säugern, die somit durch das Fremd-P450 gestört werden könnte. Durch Extraktion des endogenen Nicotins aus den Blättern von transgenen und nicht-transgenen Pflanzen und die nachgeschaltete Analytik mittels HPLC (und GC-MS) konnte abhängig von der geschätzten Enzymmenge über eine Western-Blot-Analyse ein Einfluss des CYP1A2 durch Erniedrigung des endogenen Nicotin-Gehaltes des Tabaks festgestellt werden.