Projektlaufzeit: 1999 - 2003     

Leitung:

Dr. rer nat. Burkhard Schmidt
Prof. Dr. rer. nat. Ingolf Schuphan

Bearbeitung:

Maren Bode
Petra Stöbe
Brigitte Thiede, TA

Auftraggeber:

Eigenfinanzierung mit Unterstützung von Bayer CropScience

Projektpartner:

Dr. H.-J. Hirsch (Klonierung)
Institut für Biologie I (Molekulargenetik)
RWTH Aachen
Prof. Dr. F.P. Guengerich (cDNA Sequenzen)
Center in Molecular Toxicology
Vanderbilt University School of Medicine
Nashville, Tennessee, USA

 

Hintergrund:

Xenobiotika sind organische Verbindungen die nicht durch Organismen bio-synthetisiert werden und die folglich fremd in der Biosphäre sind. Xenobiotika umfassen Pestizide, Pharmaka und industrielle Schadstoffe; sie gelangen in die Organismen durch Zufall oder durch beabsichtigte Anwendung. Da Xenobiotika negative Effekte auf Organismen ausüben können, wird heutzutage von den entsprechenden Zulassungsbehörden aller Staaten gefordert, ihre Toxizität und ihren Metabolismus vor Gebrauch zu untersuchen. Im Falle von Pestiziden werden Metabolismus-Daten bereits in frühen Stadien bei der Entwicklung von Kandidaten benötigt, da Metaboliten unerwüschte toxische Effekte zeigen können. Ähnliches gilt für Pharmaka und bis zu einem gewissen Grad auch für industrielle Schadstoffe. Darüberhinaus spielt der Metabolismus eine entscheidende Rolle bei Toleranz, Resistenz und Suszeptibilität, z.B. bei Herbiziden und Insektiziden, sowie bei Phänomenen, die man bei Medikamenten und Carcinogenen beobachtet. Bei allen Aspekte des Metabolismus von Xenobiotika bedarf es einer vollständigen chemischen Identifizierung von Metaboliten. So wurden verschiedene in vitro-Systeme, inklusive Pflanzenzellkulturen, entwickelt um rasch ein breites Spektrum an Metaboliten zum Zweck ihrer Identifizierung zu generieren. Diese Screening-Prozeduren unterstützen unvermeidliche Studien, nachfolgend oder gleichzeitig mit Organismen unter relevanten Bedingungen durchgeführt werden.
Der Metabolismus von Xenobiotika im Menschen, in Tieren und höheren Pflanzen wird gewöhnlich in drei Phasen eingeteilt: Transformation (Phase I), Konjugation (Phase II) und Exkretion in Mensch/Tier oder Kompartimentierung in Pflanzen (Phase III). Typische Phase I- Reaktionen sind die Oxidation, Hydrolyse and Reduktion. Bei den entstehenden primären Metaboliten handelt es sich um jene Umwandlungsprodukte, die auf Grund ihrer möglichen toxischen Eigenschaften wichtig z.B. für die Bewertung von Pestiziden sind. Die wichtigsten Phase I-Prozesse sind oxidative Reaktionen. Im Menschen, in Tieren und Pflanzen sind Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450s) hauptsächlich for Oxidation von Xenobiotika verantwortlich, die erste, entscheidende Umwandlungsschritte sind. Typische Reaktionen sind die N-, O- und S-Dealkylierung, die aromatische und aliphatische Hydroxylierung, die Epoxidierung, oxidative Desulfurierung und Sulfoxidation. Die Generierung von oxidierten Metaboliten durch in vitro-Systeme zur chemischen Identifizeirung ist daher wünschenswert.
Im Menschen, sind elf P450-Isozyme für 90 % aller P450-Reaktionen, die mit Xenobiotika beobachtet werden, verantwortlich. Bei diese entscheidenden humanen P450s, die hauptsächlich in der Leber exprimiert werden, handelt es sich um CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C10, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4. Diese zeigen breite und überlappende Substratspezifitäten.
In neuerer Zeit werden Daten zur katalytischen Aktivität von P450-Isozymen gegenüber Xenobiotika meist in Studien mit Bakterien oder Hefen, die P450-Gene heterolog exprimieren, oder Mikrosomen (kommerziell erhältlich), die bestimmte humane P450s enthalten und mittels bakterieller (Escherichia coli) oder Baculovirus-abhängiger Expressionssysteme produziert werden, ermittelt. Diese Systeme erfordern die Co-Expression einer NADPH-P450-Reduktase (als Lieferant der erforderlichen Elektronen), um katalytisch aktive P450s zu erhalten. In den letzten 15 Jahren, wurden Studien zur Überexpression humaner P450-Isozyme der Familien CYP1-3 in höheren Pflanzen (Tabak, Kartoffel, Reis) publiziert. Die Pflanzen wurden mit einem einzelnen oder mehreren P450-Genen transformiert. Ziele dieser Studien waren die Herstellung von entweder Herbizid-resistenten Pflanzen (z.B. Chlortoluron) oder Pflanzen, die geignet für die (Phyto-) Sanierung kontaminierter Flächen sind. Bedingt durch die breite Substratspezifität, wiesen die transgenen Pflanzen eine stark erhöhte Metabolismusaktivität gegenüber einigen Herbiziden (multiple Resistenz) oder eine Reihe Kontaminanten auf. Alle Experimente belegten, dass die Co-Expression von NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase nicht erforderlich war; die humanen P450s kooperierten ausreichen gut mit endogenen pflanzlichen Reduktasen.
Das Projekt verbindet i) die wichtige Rolle von P450s beim Xenobiotika-Metabolismus, ii) die breite Substratspezificität humaner P450s, iii) das zweckmäßige in vitro-System pflanzlicher Zellkulturen, das oft in unserem Labor eingesetzt wird, und iv) die einfache Art und Weise, in der katalytisch aktive P450s in Pflanzenzellen exprimiert werden können. Es ist gedacht als Methode, um rasch und qualitativ die Hauptmuster oxidierter Metaboliten von Xenobiotika zu ermitteln und speziell interessierende Metaboliten in größerem Maßstab für eine vollständige chemische Identifizierung zu produzieren. Das Projekt stellt einen ersten Schritt einer Reihe von Untersuchungen dar. Dazu wurden Zellsuspensionskulturen von Tabak mit den Genen von humanem CYP1A1 und CYP1A2 transformiert. Die resultierenden P450-transgenen Zellkulturen wurden dannin Metabolismusstudien mit den Herbiziden Atrazin und Metamitron sowie dem Insektizid Dimethoat eingesetzt.